siRNA, RNAi, off-target effect

RNAi(RNA interference)

• siRNA(short interfering RNA)라 불리는 12~21 mer의 dsRNA에 의해 서열 특이적으로 유전자 발현이 억제되는 현상 --> RNA 간섭
• gene silencing by RNAi
• RNA 간섭을 이용해 특정 유전자의 활성을 억제할 수 있음
• 표적 mRNA와 상보적 관계에 있는 이중가닥 RNA 를 세포에 도입하는 방법으로 억제 가능
• 단점: 효과가 일시적일 수 있으며, 다른 유전자 발현도 억제할 수 있음

siRNA(short interfering RNA)

• off-target effect 줄여서 design 해야함

Off-target effect

• siRNA를 이용한 RNAi의 부작용, 다른 유전자 발현도 억제되는 현상

 

https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=155785

 

mRNA

• 3개의 부분으로 구성

• 실제 단백질을 코딩하는 몸통 부분, 단백질 코딩하지 않는 머리와 꼬리 부분

• 머리와 꼬리 부분 → 번역되지 않는 부분(UTRs: untranslated regions)

• UTRs 중에서도 머리 부분은 단백질 합성 시작하는 데 관여하지만 꼬리부분(3’ UTR)은 어떠한 역할도 하지 않음
  

3’ UTR

• mRNA의 머리와 몸통만 세포에 주입한 결과 정상적인 단백질 생성되지만, 3’ UTR(꼬리) 부분에 단백질의 생성을 조절하는 프로그램이 내장되어 있다고 밝혀짐

• 이 부분이 정상적인 세포의 암화를 예방하는 역할 하기도 한다고 발표

•  암세포의 mRNA: 길이 짧으며 일부는 mRNA 3’UTR의 95%가 상실되어 있음

• 짧아진 3’ UTR → 정상 mRNA에 비해 2~40배나 많은 단백질 생성 → 과잉 생성된 단백질은 정상세포를 암세포로 전환시킴

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siRNA Mismatch tolerance

•  siRNA와 target sequence의 불일치 허용오차

With at least three mismatches, there are typically four or five contiguous matches, so that a BLAST search frequently overlooks off-target candidates.

 

• 적어도 3개의 mismatches → 4, 5개의 연속적 matches → off-target 후보들 간과

 

The use of siRNA sequences of mismatch tolerance 3 or more would be an effective criterion to avoid off-target activity. 

 

Moreover, siRNA sequences are short, ca. 19 nt, and they should contain at least three mismatches with non-targets. Consequently, there are typically 3–6 contiguous matches between an siRNA sequence and its potential off-targets (Fig. 1).

 

• siRNA의 mismatch tolerance 3 or 그 이상이 off target  활동 피할 수 있음
• siRNA는 19nt, 짧음 + non-target과의 mismatch를 세개 이상 포함해야함

 

Mismatch tolerance of siRNA had greatly elevated in the 3’ UTR than coding region. 

 

This strongly suggested that the difference in siRNA silencing of mismatched sites located in the coding region or 3′-UTR was not due to different slicer activity, but due to translational repression activity that only occurred in the 3′-UTR, in a way similar to miRNA, which represses translation primarily in the 3′-UTR [19], [30], [36]. 

 

• siRNA의 mismatch tolerance는 mismatch site가 3’ UTR이면 더 커짐(high tolerance)

 

One common conclusion out of several such investigations indicated that central mismatches between the siRNA guide strand and the mRNA target are more critical than mismatches occurring toward either the 3′ or 5′ end. 

 

In accordance to earlier studies (13), we can confirm that position 5–11 seems to be highly sensitive to nucleotide alterations and most of the constructs with at least one mutation in this area causes reduced knockdown efficiency, which results in remaining luciferase expression levels of more than 50%. 

 

• mRNA와 siRNA가 중간에서 mismatch이면 더 critical → low tolerance 가짐

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참고 논문

1. Analysis of siRNA specificity on targets with double-nucleotide mismatches
2. A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites
3. 3’ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets
4. siRNA Has Greatly Elevated Mismatch Tolerance at 3′-UTR Sites
5. siRNA-mediated off-target gene silencing triggered by a 7 nt complementation
6. Accelerated off-target search algorithm for siRNA